DNA疫苗的介绍

1. DNA疫苗的介绍

DNA疫苗(DNA vaccine)，又称“裸”DNA疫苗(naked DNA vaccine)、基因疫苗(genetic vaccine)，亦有核酸疫苗(nucleic acid immunizaiton)、多核苷酸疫苗(poly nucleotide vaccine)等相关名称，是近年来基因治疗研究中所衍生并发展起来的一个新的研究领域。

2. 生物技术疫苗的DNA疫苗

（DNA vaccine）这是一种最新的分子水平的生物技术疫苗，应用基因工程技术把编码保护性抗原的基因与能在真核细胞中表达的载体DNA重组，这种目的基因与表达载体的重组DNA可直接注射（接种）到动物（如小鼠）体内，目的基因可在动物体内表达，刺激机体产生体液免疫和细胞免疫。

3. DNA疫苗的主要原理

4. 中国首个DNA疫苗获批是用来预防什么病的？

5月30日，从中国农业科学院哈尔滨兽医研究所研获悉，根据国家农业农村部第30号公告，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所研制的用于预防H5亚型禽流感的DNA疫苗，获得国家一类新兽药证书。据悉，该疫苗的获批，成为中国首个人和动物的DNA疫苗产品。

据中国农业科学院哈尔滨兽医研究所相关技术人员介绍，DNA疫苗是将编码目的抗原蛋白基因序列的质粒经肌肉注射导入宿主细胞，通过转录系统表达抗原蛋白，诱导宿主产生针对该抗原蛋白的免疫应答，从而达到免疫目的的新型基因工程疫苗。
DNA疫苗使用后不仅能够诱导良好的体液免疫反应，还可诱导较强的细胞免疫应答，具有环境友好和可靠的生物安全性等特点，是未来人和动物预防与治疗疫苗重要的技术发展方向之一。

中国农业科学院哈尔滨兽医研究所相关负责人表示，该所动物流感团队历经20余年，采用了优化的DNA疫苗构建策略，攻克了大规模高密度培养、高水平调控表达、大规模非层析柱DNA纯化等核心技术，建立了严格的质量控制标准体系，创建了成熟、完整、高效的DNA疫苗研发和技术工艺平台，多项自主独创技术处世界领先水平。

5. DNA疫苗的主要问题

目前，DNA疫苗尚未得到广泛的应用，除了因为它是一种新事物，不大为人所了解之外，它本身的安全问题则是人们对它 的最大顾虑。DNA疫苗存在的问题如下：外源DNA进入机体后是否整合到宿主基因组，导致癌基因激活或抑癌基因失活。疫苗DNA长期在体内表达是否会诱导机体产生免疫耐受，长远来说，导致机体免疫功能低下。疫苗DNA 作为一种外来物质，是否会引起机体产生抗DNA抗体。DNA疫苗诱导的CTL反应是否会对其他细胞产生杀伤作用。

6. DNA疫苗的具体特征

DNA疫苗不同于传统的疫苗，DNA疫苗旨在将病原微生物的某种专门组分的裸露DNA编码直接注入机体内。尽管此类疫苗尚未面世，但其在技术上的飞速发展有可能开创免疫学的新纪元。目前正在研制的此类疫苗包括疟疾、流感、轮状病毒、HⅣ等。该疫苗既具有减毒疫苗的优点。同时又无逆转的危险，因此越来越受到人们的重视，被看作是继传统疫苗及基因工程亚单位疫苗之后的第三代疫苗。DNA疫苗能诱导细胞免疫和体液免疫。消除导入可能与减毒疫苗相关的强毒力病毒的危险性。使用一次，即能产生长期免疫力，无须增加剂量，并可提高依从性。多个病原体的基因可装在同一个质粒上，减少了疫时多次注射的不适。DNA可以干粉形式保存数年，且仍保持起活性。DNA疫苗具有许多优点：①DNA接种载体（如质粒）的结构简单，提纯质粒DNA的工艺简便，因而生产成本较低，且适于大批量生产；②DNA分子克隆比较容易，使得DNA疫苗能根据需要随时进行更新；③DNA分子很稳定，可制成DNA疫苗冻干苗，使用时在盐溶液中可恢复原有活性，因而便于运输和保存；④比传统疫苗安全，虽然DNA疫苗具有与弱毒疫苗相当的免疫原性，能激活细胞毒性T淋巴细胞而诱导细胞免疫，但由于DNA序列编码的仅是单一的一段病毒基因，基本没有毒性逆转的可能，因此不存在减毒疫苗毒力回升的危险（Davis等，1999），而且由于机体免疫系统中DNA疫苗的抗原相关表位比较稳定，因此DNA疫苗也不象弱毒疫苗或亚单位疫苗那样，会出现表位丢失（Donnelly等，1999）；⑤质粒本身可作为佐剂，因此使用DNA疫苗不用加佐剂，既降低成本又方便使用（Babiuk等，1999）；⑥将多种质粒DNA简单混合，就可将生化特性类似的抗原（如来源于相同病原菌的不同菌株）或1种病原体的多种不同抗原结合在一起，组成多价疫苗，从而使1种DNA疫苗能够诱导产生针对多个抗原表位的免疫保护作用，使DNA疫苗生产的灵活性大大增加。

7. DNA疫苗的应用领域

1伪狂犬病病毒（PRV) 将编码PRVgC或gD基因的质粒DNA免疫猪，能诱导保护性抗体的生成和细胞免疫的产生；将编码gB、gC、gD的多种质粒DNA混合使用，对引导免疫反应更有效2猪流感病毒（HⅣ） Mackling等（1998）的试验结果表明，编码HⅣ1株的血凝素（HA）和核衣壳蛋白（NP）质粒DNA用金颗粒包裹，以基因枪轰击猪的表皮进行免疫后，HA质粒DNA能使猪产生粘膜免疫反应而对流感病毒的攻击具有抵抗力，DNA疫苗引起的免疫反应与灭活疫苗相当。3 猪呼吸与繁殖综合征病毒（PRRS) PRRS基因片段ORF5编码的主要囊膜糖蛋白GP5是该病毒的3个主要结构蛋白之一。含有ORF5基因质粒DNA能诱导猪抗GP5特异性中和抗体的产生；且免疫猪的外周血单核细胞在GP5重组蛋白存在时能够发生转化反应，显示了GP5特异性细胞免疫的产生（Pirzadeh B等，1998）。Meng（2000）将GP5基因克隆入巨细胞病毒（CMV）早期启动子的控制之下构建成真核表达质粒而制备出DNA疫苗，用其免疫仔猪后可诱导抗体的产生，实验室攻毒后显示出良好的保护效果。4口蹄疫病毒（FMDV) 将FMDV全长基因组的cDNA克隆到质粒，并去除其编码核衣壳蛋白VP1的细胞结合部位的DNA序列，构建成质粒DNA以肌肉或皮内注射，初次免疫后2～4周，可使所有的猪都产生特异的病毒中和抗体，攻毒试验中呈现部分保护作用5猪瘟病毒（CSFV) 余兴龙等（2000）构建了CSFV主要保护性抗原E2基因4种不同的真核表达质粒。小鼠免疫试验结果表明，E2基因上不同的功能区对基因疫苗的免疫应答有很大影响，有信号肽序列的E2基因可诱导特异性的免疫反应，且无跨膜区序列的E2基因所诱导的免疫应答反应比有跨膜区序列的强，而无信号肽序列的E2基因所诱导的免疫应答反应比有跨膜区序列的强，而无信号肽序列的E2基因则不能诱导产生CFSV特异性的免疫反应。攻毒保护试验结果表明，免疫家兔最少可抵抗10个最小感染剂量（MID）的猪瘟兔化弱毒苗（HCⅣ）的攻击；免疫猪可抵抗致死剂量的CFSV石门株强毒的攻击。6牛呼吸道合胞体病毒（BRSV) 用BRSV G基因构建的DNA疫苗，以无针方式免疫小牛时比皮内或肌肉注射引起的免疫反应强烈。牛疱疹病毒（BHV) 用表达BHV?1 gD基因的质粒DNA疫苗免疫牛，能产生很高的中和抗体；攻毒试验后发现，免疫组比非免疫组的病毒排放量明显减少（schrijver R S等，1997）。此疫苗通过肌肉或皮内注射均可引导免疫反应的产生。但皮内注射引起的免疫反应更强7牛病毒性腹泻病毒（BVDV) 以表达BVDV1型主要糖蛋白E2的质粒DNA肌肉注射小牛，可产生病毒中和抗体和抗原特异的细胞增殖反应；免疫后16周进行攻毒试验，发现免疫牛能产生针对BVDV1型和2型的血清中和抗体强烈的记忆抗体反应，对牛有部分免疫保护作用8新城疫病毒（DNV) Sakaguchi等（1996）将NDV F基因插入质粒载体，F基因的表达受巨细胞病毒早期增强子和鸡β?肌动蛋白启动子控制。1周龄试验鸡肌肉内注射重组质粒后，有2/5注射线性质粒的鸡和4/5注射线性质粒与脂质体转染剂混合物的鸡产生了高水平针对F蛋白的抗体，而注射闭环状质粒的鸡不能产生抗体。免疫9周后，体内有抗体的试验鸡都能抵抗致死剂量NDV强毒的攻击。9鸡传染性喉气管炎病毒（ILT) 将分别构建的含有鸡传染性喉气管炎病毒王岗株gB、gC和gD基因的重组真核表达质粒及空载体质粒分组注射雏鸡，攻毒后观察免疫保护效果。结果表明，重组质粒诱导了免疫应答，免疫保护率达到79%，该基因疫苗可以作为预防ILV的1个补充。10禽流感病毒 Robinson等（1993）最先将DNA疫苗用于鸡，以编码禽流感病毒H7N7株血凝素（HA）基因的质粒（DNA）由不同途径（静脉、腹腔、皮下注射）免疫3周龄鸡，可对致死剂量的H7N7株病毒鼻内攻击产生50%的保护。Fyna等（1993）为了研究DNA疫苗对鸡最有效的免疫途径，将100～200 μg编码H7?HA的质粒DNA通过静脉、肌肉、皮下注射、点眼、囊内、滴鼻等方式免疫3周龄鸡。4周后进行第2次免疫。第6周，用致死剂量的H7N7攻击，免疫鸡的存活率达10%～63%，而对照组的存活率只有2%。其中，多种途径如静脉和肌肉注射共同免疫的效果，比单一途径如肌肉注射、点眼、法氏囊内、滴鼻免疫效果好。Kodihalli等（1997）将编码H5?HA的质粒DNA以0.25、0.5、1.5或10 μg用基因枪免疫鸡，4周后以100LD?50的Ty/lre/83株鼻内免疫进行攻击，低至0.25 μg剂量的DNA可使50%的免疫鸡存活。而1、5、10 μg的剂量可完全抵抗致死剂量病毒的攻击。DNA疫苗对致死剂量的抗原变异株也可提供95%的保护，证实DNA流感疫苗具有广阔的发展前景。DNA疫苗的安全性虽然人们对于使用DNA疫苗的安全性存有疑虑，担心DNA可能会整合到宿主细胞的染色体上而造成插入突变，但众多研究结果并未发现有插入突变的现象。质粒DNA在动物体内会缓慢降解，不会造成动物的自体免疫（陈化兰等，1998），也不随卵子和精子传入子代体内，它随生物链进入其他物种体内时也会失活，而且对环境的污染很小，因此其危险性远低于现用疫苗。

8. DNA疫苗的注射途径

直接肌肉注射注射的DNA在肌肉细胞中以环型分子存在，不能复制，并不能整合到宿主细胞染色体中。肌肉细胞中特有的横管系统与细胞外空间有直接交通，因而可能介导质粒 DNA的内吞作用。而且横纹肌中溶酶体和DNA酶的含量较低，可能也是质粒DNA能在细胞中存在较长时间的原因。微离子轰击介导的DNA免疫即基因枪。其技术依据是亚微粒的钨和金能自发地吸附DNA，将包裹有金粉或钨粉的 DNA 质粒，借助高能电场以极快的速度轰击动物表皮组织，能获得满意的免疫效果。